Tip:
Highlight text to annotate it
X
Bine ați venit la Novus vizual seria protocolul
În acest film veți învăța *** să efectueze toate etapele de fluorescent
imunocitochimie
folosind metodele cele mai comune pentru acest test.
Înainte de a începe procedura de ICC, vom demonstra *** să se pregătească
lamele și plăci de cultură de celule, urmată de acoperire a celulelor noastre.
Vom începe cu acid tratarea lamele de noi într-una molar de acid clorhidrat de
24 de ore.
După decantare cu atenție pe acid și eliminarea lamele de sticlă,
ne spalam fiecare cu apă distilată,
apoi un final se spală cu etanol.
Ca un pas opțional, puteți plasa lamele într-un rack subbing
scufunda-l
o 0.1 mg / soluție de gelatină sau polylysine
timp de cinci minute.
Acestea aide acoperire în furnizarea de aderenta suplimentara de celule pentru a
lamele
asigurându-se că acestea nu sunt detașate în timpul etape de spălare mai târziu.
După tratamentul scoateți suportul subbing și uscați lamele din cultura
hota sau un cuptor încălzit.
Lamele curate uscate sunt apoi introduse în fiecare godeu al o perioadă de șase bine
cultura placa
și acoperite cu un capac.
Pentru a economisi timp, volume mari de plăci pot fi pregătite din timp pentru o utilizare ulterioară.
Plăcile pot fi, de asemenea, sterilizate prin plasarea lor sub lumina UV capota lui.
Cu lamele curate pregătite în șase plăci bine,
putem adăuga acum celulele noastre.
Împletit aici, în celulele adăuga o densitate de o jumătate de milion de celule pe bine.
Celulele sunt apoi cultivate peste noapte în incubator sau până când acestea ajung preferat ta
densitate.
Cu celulele placate în ziua precedentă și peste noapte de cultură, suntem gata
pentru a începe cu procedura de ICC.
Pe aceasta prima zi a ICC, vom stabili,
permeabilize,
șterge și se adaugă un anticorp primar la celule.
Începeți prin aspirarea mediu de cultură din fiecare bine, urmat de fixarea
Celulele cu formaldehidă 4% sau 10% de formol
timp de 10 minute la temperatura camerei.
Aspirat fixativ și clătiți bine de două ori, cu fiecare rece ca gheața PBS.
Aveți grijă să nu lăsați celulele se usuce în acest
sau orice pas mai departe de protocol.
Dacă epitop de proteine de interes este exprimat intracelular,
permeabilization celular este necesar pentru anticorpi pentru a avea acces la
celulă.
Deși există multe diferite
agenți permeabilization, cele mai frecvente sunt 0.1 la 0.5%
concentrare
de Tween-20
sau Triton-X100
diluat în PBS.
Tween-20 este folosit pentru epitopilor situate în citoplasma
în timp ce Triton-X100 este utilizat pentru permeabilizing nucleul si mitocondriile.
Incubați fântâni cu soluție *** permeabilization timp de 10 minute la temperatura camerei.
Aspirat *** permeabilization și se spală de trei ori timp de 5 minute fiecare, cu
PBS sfoară.
PBS firului conține 0.1% Tween-20.
Vom bloca site-uri de acum nespecifice obligatorii cu un *** de blocare timp de 1 oră
la temperatura camerei.
*** de blocare este mai bun PBST, ce conține 10% ser de la gazdă
specii de anticorpi secundară.
Cu toate acestea,
1% BSA în PBST, ce poate fi, de asemenea, utilizate.
Pregătiți anticorpi primar prin diluarea într-un *** de blocare
la diluare recomandată prevăzută de foaia de date.
Diluții multiple stricte sunt benefice a ține cont de variabilele care pot fi
diferită în testul dvs.
și pentru realizarea celor mai bune rezultate.
Se incubează la 4 grade Celsius peste noapte.
În exemplul nostru,
din moment ce suntem cu ajutorul unui primar neconjugată, vom folosi un fluorofor
conjugat secundar în a doua zi.
În ziua a doua a procedurii noastre de ICC
vom adăuga anticorpi nostru secundar,
efectua o etichetare facultativă dublu și etichetarea pas nucleare,
monta lamele noastre la diapozitive,
și să obțină imagini de anticorpi noastre cu un microscop fluorescent.
În primul rând am aspirat pe primar soluție anticorpi în urma prin spălarea celula
de trei ori cu SSTF timp de cinci minute fiecare.
Pregăti următoarea anticorpul conjugat floraform secundar care va lega de primar
anticorpi.
Diluați *** de blocare secundar
cu diluție recomand specificată pe foaia de date
si incubat la temperatura camerei timp de o oră.
Acoperirea cu folie de plăci împiedică coloranți sensibile din degradante.
Aspirati pe soluția anticorpul secundar, urmată de spălare a celulelor
de trei ori cu SSTF
timp de cinci minute fiecare.
Ca un pas opțional oa doua pereche primar și secundar pot fi folosite
pentru a vizualiza un epitop secunde
prin utilizarea unui alt etaj pentru el.
În plus, ADN coloranți obligatorii, *** ar fi DAPI
poate fi aplicat fără a fi nevoie de anticorpi secundari.
Se referă la protocol complet Novus scris pentru instrucțiuni suplimentare cu privire la modul în care să se dubleze și
triplu etichetă.
Lamele sunt acum gata pentru a fi montate pe lame de microscop.
Ia-o lamă, apoi se repartizează o picătură de mediu antifade de montare de lent
apelarea în jos pistonul pipetei.
Îndepărtați cu grijă o lamă de acoperire de bine,
permite spălare exces să se scurgă în afara
și locul celulelor cu fața în jos pe diapozitiv.
Poloneză unghia clar pot fi folosite pentru a sigila lamă de acoperire și pentru a preveni-l de la
uscarea.
Slide-uri pot fi acum vizualizate sub un microscop
sau stocate la -20 de grade Celsius sau 4
într-o cutie de diapozitive întunecată sau carte de diapozitive.
Limitarea cantitatea de timp în care fiecare diapozitiv este expus la lumina microscop voința aide în
prelungirea semnalul fluorescent
și vor preveni fotografie albire.