Tip:
Highlight text to annotate it
X
Bine ați venit la Novus protocol Seria Visual.
În acest videoclip vom învăța *** să efectueze toate fazele unui Western Blot utilizând
Metodele cele mai comune pentru acest test.
Înainte de a începe pregătirea pată trebuie să ne pregătim prima lizat nostru eșantion.
În acest exemplu, vom pregăti un lizat de proteine din celule de cultura.
Aici ne spalam celulele de două ori cu PBS rece ca gheața și suficient de *** de liză
pentru a acoperi celulelor.
Alegerea *** de liză depinde în mare măsură de localizare
de proteine de interes.
Noi racla celulele și se transferă soluția de celule pe un tub de centrifugare
introduse pe gheață.
În scopul de a solubiliza proteinele membranare legate, vom solicita mai puternici
detergenți de extracție în comparație cu proteinele citoplasmatice izolate.
În acest exemplu vom folosi un *** RIPA standard, care este un *** comună
pentru obținerea randamentului maxim de proteine. În timp ce extragerea proteine din toate
localizări celulare,
este foarte important să se includă inhibitori de protează în *** de liză dvs., care va
preveni degradarea proba ta. Utilizați întotdeauna protează proaspăt preparată
inhibitori, păstrați probele pe gheață și de a lucra rapid.
Noi păduchi celulele prin pipetarea în sus și în jos
urmată de incubare pe gheață timp de treizeci de minute.
Apoi se centrifughează celulele într-o pelete.
Aruncați pelete și se colectează lichidul supernatant. Acest lucru este lizat ta.
Se determină concentrația de proteine totală de lizat proba ta de
testarea o mică parte din lizat cu o proteina disponibil în comerț
testul de cuantificare, *** ar fi BCA.
Acest lucru vă va ajuta la încărcare, cantitati egale de proteine in gel ta.
Pete de Vest sunt în mod tradițional preformate sub redusă și denaturat
condiții.
Aceste condiții vor permite proteine pentru a fi separată de greutatea lor moleculara
mai degrabă decât forma lor nativă conformationala sau taxe.
Pentru a reduce și denaturarea probelor,
se diluează fiecare într-un *** de încărcare, *** ar fi *** tradițională Laemmli.
Acest *** conține beta-mercaptoetanol, sau DTT, pentru a reduce disulfura
crestele între cysteines,
SDS a asista denaturare un furniza o proteina net negativ,
glicerol, pentru a permite probelor să se scufunde în fiecare godeu,
Albastru de bromfenol pentru a vizualiza Lizatul
și un *** iconic.
Votex fiecare probă și se incubează la 95 de grade Celsius timp de cinci minute la
denatura complet proteine. Sunteți acum gata pentru a încărca mostre într-o
SDS pagina gel.