Tip:
Highlight text to annotate it
X
După electrotransfer de proteine noastre într-o membrană, vom bloca acum
șterge,
se aplică un anumit anticorp primar pentru proteine noastră de interes și apoi un anticorp secundar
care va recunoaște anticorpi primar.
Începeți prin eliminarea membrana din casetă și clătire de trei ori în
apă.
Ca un pas opțional, putem verifica proteinele au fost transferate cu succes
prin colorarea membranei cu Ponceau roșu.
Se incubează membrana în Ponceau timp de cinci minute și se spală cu apă până la
benzile sunt clare.
După verificare blot poate fi apoi de-vitraliu, continuând să se spele cu
apă sau TBS firului pana cand vopseaua este complet eliminat.
Avem nevoie pentru a bloca toate domeniile de pată, care nu conțin deja proteine.
Acest lucru va preveni non-specifice cu caracter obligatoriu de anticorpi și a reduce generală
fundal de semnal.
Tampoane comune includ blocarea de 5% fără grăsimi din lapte uscat pentru testul
într-o soluție TBS sfoară.
Cu toate acestea, nu utilizați lapte atunci când palpare cu anticorpi fosfo specifice pe care le poate
cauza de fond mare de la fosfoproteină său endogen, cesiu.
Se incubează membrana cu soluție de blocare pentru o oră la temperatura camerei
sub agitare ușoară.
Se decantează soluția de saturare și se spală cu TBS sfori timp de cinci minute.
Acum suntem gata pentru a scrie anticorpi nostru. Se diluează anticorpi primar într-un
*** de blocare, la concentrația recomandată pe foaia de date.
Se incubează peste noapte la 4 grade Celsius, cu agitare blândă.
Un pas opțional recomandată este de a folosi, de asemenea, un control pozitiv de anticorpi încărcate
care permite utilizatorului să verifice cantitati egale de proteine totale au fost încărcate în fiecare
precum și a ajutoarelor în rezolvarea problemelor prin eliminarea tuturor incertitudinilor
cu procedura de Western Blot. În ziua următoare, se decantează în afara anticorpi primar și
spală membrana cu volume mari de TBS sfori și agitarea energică
de cinci ori pentru cinci minute fiecare.
Aceste spălări stricte sunt extrem de importante pentru eliminarea non-specifice
fundal semnale.
După spălare, se diluează anticorpul secundar în soluție și blocarea
se incubează membrana pentru o oră la temperatura camerei, la concentrația
a recomandat pe foaia de date.
În exemplul nostru secundar este, de asemenea, conjugat cu HRP pentru mai târziu
de detectare.
Membrana decantează și secundare, cu volume mari de TBS sfoară cu spălare
agitarea energică de cinci ori, timp de cinci minute fiecare. Sunteți acum gata pentru
detecție fază.