Tip:
Highlight text to annotate it
X
Cu celulele placate în ziua precedentă și peste noapte de cultură, suntem gata
pentru a începe cu procedura de CPI.
Pe aceasta prima zi a ICC, vom stabili,
permeabilize,
șterge și se adaugă un anticorp primar la celule.
Începeți prin aspirarea mediu de cultură din fiecare bine, urmat de fixarea
Celulele cu formaldehidă 4% sau 10% de formol
timp de 10 minute la temperatura camerei.
Aspirat fixativ și clătiți bine de două ori, cu fiecare rece ca gheața PBS.
Aveți grijă să nu lăsați celulele se usuce în acest
sau orice pas mai departe de protocol.
Dacă epitop de proteine de interes este exprimat intracelular,
permeabilization celular este necesar pentru anticorpi pentru a avea acces la
celulă.
Deși există mai multe agenții diferite permeabilization, cele mai frecvente
sunt 0.1 - 0.5% din concentrația de Tween-20 sau
Triton-X100
diluat în PBS.
Tween-20 este folosit pentru epitopilor situate în citoplasma
în timp ce Triton-X100 este utilizat pentru permeabilizing nucleul si mitocondriile.
Incubați fântâni cu soluție *** permeabilization timp de 10 minute la temperatura camerei.
Aspirat *** permeabilization și se spală de trei ori timp de 5 minute
fiecare cu PBS sfoară.
PBS firului conține 0.1% Tween-20.
Vom bloca site-uri de acum nespecifice obligatorii cu un *** de blocare timp de 1 oră
la temperatura camerei.
*** de blocare este mai bun PBST, ce conține 10% ser de la
găzdui specii de anticorpi secundară.
Cu toate acestea, BSA 1% în PBST, ce poate fi, de asemenea, utilizate.
Pregătiți anticorpi primar prin diluarea într-un *** de blocare, la recomandată
diluare specificată pe foaia de date.
Diluții multiple stricte sunt benefice a ține cont de faptul că variabilele
poate fi diferit în analiza și
pentru obținerea celor mai bune rezultate.
Se incubează la 4 grade Celsius peste noapte.
În exemplul nostru, deoarece vom folosi un primar neconjugată, vom folosi un fluorofor
conjugat secundar în a doua zi.