Tip:
Highlight text to annotate it
X
Bine ați venit la Novus protocol Seria Visual.
În acest videoclip vom învăța *** să efectueze toate fazele unui Western Blot utilizând
Metodele cele mai comune pentru acest test.
Înainte de a începe pregătirea pată trebuie să ne pregătim prima lizat nostru eșantion.
În acest exemplu, vom pregăti un lizat de proteine din celule de cultura.
Aici
ne spalam celulele de două ori cu PBS rece ca gheața
și *** de liză suficient pentru a acoperi celulelor.
Alegerea *** de liză depinde în mare măsură pe dvs.
alegerea de proteine de interes.
Noi racla celulele și se transferă soluția de celule pe un tub de centrifugare
introduse pe gheață.
În scopul de a solubiliza proteinele membranare legate, vom solicita mai puternici
detergenți de extracție în comparație cu proteinele citoplasmatice izolate.
În acest exemplu,
se foloseste un *** RIPA standard,
care este un buffer comun pentru obținerea randamentului maxim de proteine. În timp ce extragerea
proteinele din toate localizarile celulare,
este foarte important să se includă inhibitori de protează în *** de liză dvs., care va
preveni degradarea proba ta. Utilizați întotdeauna protează proaspăt preparată
inhibitori, păstrați probele pe gheață și de a lucra rapid.
Noi păduchi celulele prin pipetarea în sus și în jos
urmată de incubare pe gheață timp de 30 de minute.
Apoi se centrifughează celulele într-o pelete.
Aruncați pelete și se colectează lichidul supernatant. Acest lucru este lizat ta.
Se determină concentrația totală a lizat de proteine de
testarea o mică parte din lizat dvs.
cu un disponibil în comerț proteine testul cuantificarea
*** ar fi BCA.
Acest lucru vă va ajuta la încărcare, cantitati egale de proteine in gel ta.
Pete de Vest sunt de obicei preformate sub redusă și denaturat
condiții. Aceste condiții vor permite proteine pentru a fi separat de către lor
greutate moleculară
mai degrabă decât forma lor nativă conformationala sau taxe.
Pentru a reduce și denaturarea probelor,
se diluează fiecare într-un *** de încărcare, *** ar fi *** tradițională Laemmli.
Acest *** conține beta-mercaptoetanol, sau DTT, pentru a reduce crestele disulfidice
între cysteines,
SDS a asista denaturare o proteina net negativ,
glicerol, pentru a permite probelor să se scufunde în fiecare godeu,
Albastru de bromfenol pentru a vizualiza lizat și un *** iconic.
Votex fiecare proba, la 95 de grade Celsius timp de cinci minute la
denatura complet proteine. Sunteți acum gata pentru a încărca mostre
într-o pagină de gel SDS.
Pentru acest pas, vom separa proteinele individuale în eșantionul nostru
Lizatul
bazează pe greutatea lor moleculară
utilizând un electrod pozitiv pentru a atrage o proteina încărcat negativ.
Pentru a face acest lucru
ne încărca noastre de probe pregatite dinainte de proteine într-un disponibil în comerț
poliacrilamidă gel.
Geluri sunt disponibile în procente fixe sau degradeuri de acrilamidă.
Mai mare acrilamidă mai mică proporția de gel
procent.
Prin urmare, geluri procentuale mari sunt mai bune pentru proteine cu greutate mică, procentul scăzut
geluri sunt mai bune pentru proteine greutate mari și geluri înclinare pot fi folosite pentru
proteinele de toate dimensiunile
datorită gamei variate în dimensiunea porilor.
Pregătiți gel dvs. prin inserarea ei în aparatul de electroforeză și
umplere cu *** de rulare, care este adecvat pentru chimie gel dumneavoastră.
Clătiți fântânile de gel cu care rulează și se adaugă *** *** pentru
camere.
Încărcați probe în fântâni.
Dacă nu sunteți sigur de suma pentru a încărca,
10-30 micrograme de proteină totală este un punct de pornire sugerat
precum și valoarea totală a eșantionului încărcate.
Veți avea nevoie, de asemenea, să rezerve cel puțin un bine pentru greutate moleculară prestained
scara.
Scara va permite să monitorizeze separarea de proteine în timpul
electroforeza și să verifice, ulterior, greutatea proteine din probă în timpul
Analiza mai târziu.
Închideți unitatea de electroforeză și conectați-l la o sursă de alimentare. Cele mai multe unități
executa de obicei 45-60 de minute la 200 de volți
sau până când *** de încărcare ajunge la partea de jos a gelului.
În acest timp proteinele încărcate negativ în fiecare probă vor migra spre
electrodul pozitiv perceput de luare drumul lor prin poliacrilamide
gel matrice.
În acest pas, vom transfera proteine noastre separate de gel
și într-o membrană solidă sau blot.
Aceasta se bazează pe același principiu ca și pasul anterior
în care un câmp electric se plătește pentru a elimina proteinele negativ
spre un electrod pozitiv.
Transferul poate avea loc sub carosabil umed sau semi-uscat.
Aici vom demonstra metoda tradițională de transfer umed. Începeți prin îndepărtarea
gel de la caseta de
tăierea partea de sus conține fântâni.
Notch colțul din stânga sus pentru a orientării gel indicat.
Plutesc gel în *** de transfer în timp ce pregătirea sandwich-transfer.
Pentru a face sandwich-de transfer
veți avea nevoie de o casetă,
burete, hârtie de filtru
gel
și alegerea dumneavoastră, fie PVDF sau membrana nitrocellulous.
PVDF trebuie mai întâi activat prin înmuierea membranei în etanol pentru
două minute. Dar, altele decât această PVDF sau alegerea nitrocellulous
membrana este o preferință personală.
Notch colțul din stânga sus pentru a indica orientarea blot
și se incubează membrane în *** de transfer de 10 minute.
Creați o stivă prin plasarea următoarele componente
de la catod la anod negativ negru pozitiv roșu:
burete,
hârtie de filtru,
membrană,
(Aveți grijă să nu atingeți gel sau membrană cu mâinile goale și de a folosi
pensete curate sau o spatulă loc.
Atingerea membrana în timpul oricărei faze pot contamina pată și să conducă la
excesiv de fundal de semnal. ),
hârtie de filtru
și burete.
Utilizați o rola curat, cu fiecare strat să se rostogolească ușor în afară bulele care ar putea fi
prezenta
deoarece bulele vor inhiba proteina de transfer eficient.
Blocarea casetă și puneți-l în aparat conține rece
transfera ***
asigurându-se că caseta este corect poziționat de la negativ la pozitiv.
În scopul de a preveni acumularea de căldură, este benefic de a transfera cu o raceala
ambalaj în aparat
aparat sau într-o cameră rece, cu bara rotativa plasat la partea de jos a camerei.
Închideți camera și conectați la o sursă de alimentare.
Efectuați transferul în conformitate cu instrucțiunile producătorului, care este
în mod normal, 100 de volți, pentru 30-120 minute.
După electrotransfer de proteine noastre într-o membrană, vom
bloca acum blot,
se aplică un anumit anticorp primar pentru proteine noastră de interes și apoi un secundar
anticorpi, care va recunoaște anticorpi primar.
Începeți prin eliminarea membrana din casetă și clătire de trei ori în apă.
Ca un pas opțional, putem verifica proteinele au fost transferate cu succes
prin colorarea membranei cu Ponceau roșu.
Se incubează membrana în Ponceau timp de cinci minute și se spală cu apă până la
benzile sunt clare.
După verificarea
blot poate fi apoi descompuse-pătate, continuând să se spele cu apă
sau TBS sfori
până la vopsea de păr este complet eliminat.
Avem nevoie pentru a bloca toate domeniile de pată, care nu conțin proteine.
Acest lucru va preveni non-specifice cu caracter obligatoriu de anticorpi și a reduce generală
fundal de semnal.
Tampoane comune includ blocarea de 5% fără grăsimi din lapte uscat pentru testul
într-o soluție TBS sfoară.
Cu toate acestea, nu utilizați lapte atunci când palpare cu anticorpi specifici fosfor
deoarece poate provoca fond mare de la fosfoproteină său endogen, cesiu.
Se incubează membrana cu soluție de blocare pentru o oră la temperatura camerei
temperatură
sub agitare ușoară.
Se decantează soluția de saturare și se spală cu TBS sfori timp de cinci minute.
Acum suntem gata pentru a scrie anticorpi nostru. Se diluează anticorpi primar într-un
*** de blocare, la concentrația recomandată pe foaia de date.
Se incubează peste noapte la 4 grade Celsius, cu agitare blândă.
Un pas opțional recomandată este de a folosi, de asemenea, un anticorp de control pozitiv
care permite utilizatorului să verifice cantitati egale de proteine totale au fost încărcate în
fiecare bine și consilierii în rezolvarea problemelor prin eliminarea oricărei
incertitudinile cu procedura Western Blot.
A doua zi,
decantează anticorpi primar și se spală membrana cu volume mari
TBS de sfori și agitarea energică
de cinci ori pentru cinci minute fiecare.
Aceste spălări stricte sunt extrem de importante pentru eliminarea non-specifice
fundal semnale.
După spălare, se diluează anticorpul secundar în blocarea soluție și se incubează
membrana pentru o oră la temperatura camerei, la concentrația
a recomandat pe foaia de date.
În exemplul nostru secundar este, de asemenea, conjugat cu HRP pentru mai târziu
de detectare.
Membrana decantează și secundare, cu volume mari de TBS sfoară cu spălare
agitarea energică de cinci ori, timp de cinci minute fiecare.
Sunteți acum gata pentru faza de detecție.
În această fază finală, vom demonstra dezvoltarea semnal folosind cele mai comune,
metodă de detectare mai sensibile și mai ieftin electrochemiluminescence
(Sau ECL) de reacție.
Această metodă utilizează enzima HRP,
care a fost conjugată cu secundară a cataliza reacția ECL și să producă
lumină.
O lumină este apoi s-au adunat pe X-ray de film și a dezvoltat
sau digitizat cu ajutorul unui aparat de fotografiat de specialitate suficient de sensibile pentru
pentru această aplicație.
Vom începe prin amestecarea in parti egale reactivi ECL într-un raport de unu-la-unu
în conformitate cu instrucțiunile producătorului.
Vom incubează membrana pentru 3-5 minute fără agitare.
După incubare, se decantează amestec ECL și de a folosi un laborator ștergeți pentru a sterge excesul de
Soluția de la colțul membranei.
Așezați membrana într-o folie de plastic transparent, *** ar fi un protector foaie pentru a preveni
uscare. Evitați permițându-membrana se usuce complet.
Putem folosi acum o rola pentru a împinge afară bulele sau orice soluție în exces.
Dezvolta imediat membrana.
Ambele sisteme de film și aparat de fotografiat vă permite să reglați manual timpul de expunere
în scopul de a asigura o imagine perfectă de Vest Blot.
Densități relative Banda poate fi cuantificată cu acum disponibil în comerț
software-ul.
. Greutate moleculară corespunzătoare pot fi, de asemenea, verificată prin compararea dimensiuni banda pentru
scara greutate moleculară.